Химия бойынша Нобель сыйлығы - 2017 • Аркадий Курамшин • «Элементтер» бойынша ғылым жаңалықтары • Нобель сыйлығы, микробиология, молекулалық биология, технология

Химия бойынша Нобель сыйлығы – 2017

Сурет. 1. Химия бойынша 2017 Нобель сыйлығының лауреаттары. Солдан оңға қарай: Жак Дубозе, Йоахим Фрэнк және Ричард Хендерсон. Суреттер sciencenews.org

Өткен аптада химия бойынша 2017 Швейцарияның Нобель сыйлығының швейцариялық Жак Дубозе, неміс-американдық Йоаким Фрэнк және Scot Richard Henderson «ерітіндінің биомолекулаларының үш өлшемді құрылымын анықтау үшін жоғары кристалды криоэлектрондық микроскопия әдістерін әзірлеу үшін қабылданады» деп жарияланды. Олардың жұмысы өткен ғасырдың 80-жылдарынан бастап микроскопияның бұл түрін сынап, бірте-бірте жақсартуға мүмкіндік берді, ол соңғы жылдары ғалымдар күрделі биологиялық молекулаларды ең кішкене бөлшектерде зерттей алады. Нобель комитетінің айтуынша, криоэлектрондық микроскопия әдісі биохимияны жаңа дәуірге айналдырып, өмір молекулалары мен тірі жүйелер туралы білімдегі көптеген кемшіліктерді толтыруға мүмкіндік берді.

Нобель комитеті криоэлектрондық микроскопияны дамытуға ең көп үлес қосқан – белоктың, нуклеин қышқылдарының және басқа молекулалардың күрделі құрылымын көрнекі түрде зерттеуге, сондай-ақ олар қатысатын процесстерді зерттеуге мүмкіндік беретін әдіс, неміс американдық американдық Жак Дюокэктің Йоахим Фрэнк пен Scot Richard Henderson.

Криогенді электронды микроскопияны заттың физикалық зерттеулерінің түбегейлі жаңа және өзін өзі қанағаттандыратын әдісі деп атауға болмайды. Керісінше, бұл трансмиссиялық электронды микроскопияның бір түрі (осы әдіс авторларының бірі, Эрнст Руска, 1986 жылы Нобель сыйлығын алды), микробиологиялық объектілерді зерттеу үшін арнайы бейімделген.

Сурет. 2 Солтүстік-Батыс Университетінде (АҚШ) криоэлектрондық микроскоп орнатылған. Суреттер vox.com

Трансмиссиялық электронды микроскопта электрондар үшін ашық (әдетте микрондардың оннан бір бөлігі және жүзден бір бөлігі) электронды үлгіні үлгі арқылы өтетін жеткілікті электрон арқылы өтіп, қозғалыстың бағытын өзгертетін электронды үлгіден өтеді. Бұл өзгерістер тіркеуге алынады (енді 2009 жылы Физика бойынша Нобель сыйлығының иегері Виллард Бойль және Джордж Смит, авторлары, ПЗС матрицасы) ең жиі пайдаланылады және талдаудан кейін пучке перпендикуляр жазықтықта зерттелетін объектінің бейнесін алуға болады. Электрондардың ішкі толқын ұзындығы болғандықтан (энергиялардағы ондаған пикометрлерэлектронды микроскоптарға тән) электронды микроскопты пайдаланып, көрінетін аймақтағы жарықтың толқын ұзындығынан әлдеқайда аз (жүздеген нанометр), оптикалық микроскопиямен, соның ішінде жоғары ажыратымдылықты флуоресценттік микроскопиядан (FVRM) қарағанда әлдеқайда тереңірек «көре» аласыз 2014 жылғы Нобель сыйлығының лауреаттары, Эрик Бетциг, Стефан Хелем және Уильям Мернер.

Электрондық микроскоптардың шекті рұқсаты – бірнеше ангстремалар (нанометрдің оннан бір бөлігі) – дерлік жетті. Бұл, мысалы, жеке атомдардың айырмашылығы бар суреттерді алуға мүмкіндік береді. Салыстыру үшін: фМБТ мүмкіндігінің шегі – 10-20 нм. Бірақ түпкілікті шешімнің әртүрлі әдістерін салыстыру үшін бұл жайсыз. Электрондық микроскоптар жоғары ажыратымдылыққа ие, бірақ олар әрқашан қолданыла бермейді. Дайындық кезінде ұнтақтауды қоспағанда, сынама зерттеудің өзі кезінде электронды сәулемен өте күрделі сәулеленуден өтеді (шамамен алғанда, пучок неғұрлым қарқынды, соғұрлым аз қателер және нәтиже жақсы), вакуумда (вакуумда ортада үлгіден тыс электрондарды шашыратпады, осылайша қажетсіз бұрмалауды енгізді).Егер сіз күрделі биологиялық молекулалар мен объектілерді зерделеу қажет болса, онда мұндай жағдайлар мүлдем орынсыз, олар сирек кездесетін ортада зақымданып жатыр және олардың ішінде әлсіз байланыстары бар, олар зерттеу барысында құлап қалады.

Қосымша жақсартусыз, электронды микроскоп биомолекулаларды және тірі жүйелерді зерттеуге бейімделе алмайды деген түсінік оның өнертабысынан кейін бірден пайда болды. Бұл туралы, мысалы, 1931 жылы Эрнст Руска электронды микроскоптың жұмыс істеу қағидатын көрсетуден кейін үш жылдан кейін Венгриялық физик Лаислав Мартон (Л. Мартон, 1934 ж. Биологиялық объектілердің электронды микроскопиясы) көрсетілді. Сол мақалада Мартон бұл мәселені шешу жолдарын ұсынды. Атап айтқанда, ол сондай-ақ, мұздату үлгілері электронды сәуленің сәулеленуінен болатын залалды азайтуға болатынын атап өтті. Мэтронның мақаласында бұл көрсетілмесе де, үлгідегі мұздату молекулалардың термиялық тербелісін азайтуға көмектеседі, бұл сонымен бірге алынған кескінді жақсартуға ықпал етеді.

1970 және 1980 жылдары ғылым мен техника барлық қиындықтарды еңсеру үшін жеткілікті даму деңгейіне жетті. Және бұл, негізінен, биылғы жылдың лауреаттарының күш-жігеріне байланысты болды.

Ричард Хендерсон алғашқы электронды микроскопты (үлгідегі салқындату) пайдаланатын атомды рұқсатсыз асимметриялық ақуыз бейнесін алды. Ол 70-жылдардың ортасында зерттеуін бастады. Алдымен Хендерсон рентгендік анализ әдісін қолданып, жасушалық мембранадан бірнеше ақуыздың құрылымын алуға тырысты, ол тіпті бірнеше ангстремнің шешілуіне мүмкіндік береді. Дегенмен, бұл әдіс жақсы нәтижеге қол жеткізе алмайтындығы анық болды: зерттелетін зат кристалды түрде болуы керек және қоршаған ортадан алынатын мембраналық ақуыздар нашар кристаллизирленеді немесе мүлдем жоғалмайды. Содан кейін ол электрондық микроскопиясына ауысты.

Белгілі бір протеин – бактериодхопсин – таңдап алынды және оны мембранасынан алып тастамау туралы шешім қабылданды, бірақ оны тікелей зерттеу. Ғалымдар вакуумдағы кептіруден қорғау үшін үлгілерді глюкоза ерітіндісімен толтырды. Бұл құрылымды сақтау мәселесін шешуге көмектесті. Сонан соң Хендерсон мен оның әріптестері электронды сәуленің әсерінен үлгілердің жойылуын сипаттаған.Бұл бірнеше факторлардың комбинациясын шешуге көмектесті.

Біріншіден, бактериодхопсина мембранамен тұрақты түрде орналасады, сондықтан бұл тұрақтылықты мұқият қарау әр түрлі бұрыштармен бірге суретке түсіргенде көп көмектеседі. Бұл пучтың қарқындылығын азайтуға және экспозиция уақытын азайтуға көмектесті, бірақ сапада жеңіске жетуге көмектесті. 1975 жылы осы ақуыздың суретін 7 ангстремнің (3-сур., R. Henderson, P. N. T. Unwin, 1975 қараңыз) күлгін мембранасының үш өлшемді моделін электронды микроскопия арқылы алуға болады.

Сурет. 3 Сол жақта: бактериялық мембрананың негізгі «суреттері» Halobacterium halobiumХендерсон тобымен алынған. Қара сызықтаршағылысқан шаш сияқты бактериодхопсин молекулаларының іздері. Олар негізінен сурет жазықтығына перпендикулярлық бағдарланған. Нүктелі сызық бұл белоктың бір молекуласының бағаланған шекарасын айналдырды. Оң: 7 ангстремнің рұқсатымен биородопсин молекуласының құрылымын үш өлшемді модельдеудің нәтижесі. Р.Хендерсон мақаласынан алынған суреттер, П. Н. Т. Унвин, 1975. Электронды микроскопия арқылы алынған мембрананың үш өлшемді моделі.

Екіншіден, Хендерсон әртүрлі ғылыми орталықтарға барып, түрлі электронды микроскоптар жасауға мүмкіндік алды. Сол жылдары ешқандай біріктіру болмағандықтан, түрлі микроскоптарда олардың артықшылығы мен кемшіліктері болды: камераны эвакуациялаудың түрлі дәрежелері,үлгідегі салқындатудың әртүрлі дәрежесі (бұл электрондық сәулеленуден болатын залалды азайтады), электронды сәуленің түрлі энергиялары, детекторлардың әртүрлі сезімталдығы. Сол себепті, бір нысанды әртүрлі микроскоптарда зерттеу мүмкіндігін алдымен кескінді алу үшін «қолайсыз» шарттарды таңдауға, содан кейін оларды бірте-бірте жақсартуға мүмкіндік берді. Осылайша Гендерсон деректер жинап, бактериодхопсиннің құрылымын анықтады. 1990 жылы ол осы ақуыздың моделі атомдық қарармен ұсынылған мақаланы жариялады (Р. Хендерсон және басқалар, 1990).

Сурет. 4 Электрондық микроскоптың көмегімен алынған бактериодхопсин үлгісі – бұл мысал ретінде Ричард Хендерсон атомдық рұқсатпен биологиялық объектілердің суреттерін алу әдісін қолдану мүмкіндігін көрсетті. Түрлі түсті қалың сызықтар – Bacteriorhodopsin атомдары арасындағы химиялық байланыстар, ақ тор торлары атомдар мен атомдық топтардың айналасындағы электрондардың тығыздығының шекараларын көрсетіңіз. Р. Хендерсон және басқалардан алынған сур., 1990. Жоғары ажыратымдылықты электронды крио-микроскопқа негізделген бактериодхопсин құрылымының моделі.

Пионердің зерттеу барысында Хендерсон криоэлектрондық микроскопия рұқсаты бар бейнелерді шығара алатындығын көрсетті,бұл рентгендік талдау әдісінен гөрі нашар емес – бұл серпіліс болған кезде. Дегенмен, бұл нәтиже бактериодхопсиннің клеткалық мембранаға тұрақты түрде орналасатынын және оны басқа «заңсыз» молекулалар үшін осындай рұқсатқа қол жеткізе алатындығының анық емес екендігін түсіндірді.

Кездейсоқ орналасқан биологиялық белсенді молекулалардың әлсіз сигналдарын өңдеу мәселесі тағы 2017 жылы Нобель сыйлығының лауреаты Иоахим Френктің шешімімен шешілді. Оның криоэлектрондық микроскопияға қосқан негізгі үлесі криоэлектрондық микроскопия көмегімен алынған екі өлшемді кескіндерді талдаудың алгоритмдерін құру болып табылады, бұл бізге жоғары сапалы үшөлшемді модельді құруға мүмкіндік береді. Осындай алгоритмдер басқа микроскопия әдістеріне арналған. Фрэнк оңтайландырылды және көптеген жолмен электронды микроскопия барысында пайда болған пайдалы ақпаратты шуылдан туындаған сигналдардан бөлуге мүмкіндік беретін математикалық талдау әдістерін жетілдірді. Электрондық құрылғыларда түрлі себептер бойынша шу пайда болады: ток пен кернеудің кездейсоқ ауытқуы электровакүл блоктарындағы электрондардың біркелкі эмиссиясымен,жартылай өткізгіш блоктарда заряд тасымалдаушылардың (электрондар мен тесіктердің өткізілуі), өткізгіштердегі жылулық қозғалыстардың (термиялық шу) немесе сыртқы кедергілердің (бәрі әдетте жақсы оқшауланғанына қарамастан) түзілудегі және рекомбинациядағы бұзылулар.

Сурет. 5 Дж. Франк ұсынған криоэлектрондық микроскопиядағы сигналдарды есептеу әдістемесі. Сайт nobelprize.org сайты

Бұл мәселе де күрделі. Егер объектілер, тіпті олар бірдей немесе шамамен бірдей болса да, олар осындай зерттеулерде болу керек, олар бір-бірін бұрмалайтын құрылымда сәл өзгеше сигналдар береді. Сонымен қатар, бұлыңғырлықтың себебі – шу немесе алгоритм қателері – анықтау оңай емес. Деректерді өңдеу принципі схематично көрсетілгендей күріш. 5: зерттелген молекуланың көптеген жалпақ суреттері шуылдан тазарып, «бұрыштар» бойынша теріледі, содан кейін жоғары сапалы профиль тығыз бұрыштары бар суреттерден тұрады және ақыр соңында осы профильдерден үш өлшемді модель жасалады.

1981 жылы Фрэнк SPIDER компьютерлік бағдарламасының бірінші нұсқасында математикалық үлгілерді жинақтады (Электронды микроскопия және оған қатысты салалардағы сурет деректерін өңдеу жүйесі, бірінші шыққан: J.Frank et al., 1981. Spider – Электрондық кескінді өңдеу үшін модульді бағдарламалық қамтамасыз ету жүйесі. Бұл бағдарламалық жасақтама әлі күнге дейін жаңартылып жатыр, сонымен қатар, бұл бағдарламалар әлемнің барлық жерінде ғалымдардың жұмысын жеңілдетеді. Фрэнк генетикалық ақпарат негізінде аминқышқылдардың белоктарының биосинтезі үшін пайдаланылатын РНҚ және оның байланысқан жасушалық органоидты белоктарынан тұратын рибосоманың бетінің бейнелерін алу үшін өзінің алгоритмдерін пайдаланды.

Сурет. 6 J. Dubcecher ұсынған криоэлектрондық микроскопия үшін үлгі дайындау әдісі. Сайт nobelprize.org сайты

Префикс «крио» үшінші лауреаты Жак Дубоченің арқасында электронды микроскопияда пайда болды. Ол сулы ерітінділерді үлгілермен тез суыту әдісін әзірледі (J. Dubochet, A.V. McDowall, 1981. Электронды микроскопия үшін суды витрификациялау). Сонымен қатар, су тезірек мұздатуы керек, бұл молекулалардың кристалдық торда уақыттың жоқтығы (аморфты мұзды қараңыз). Мұны ерітіндідегі жұқа пленканы үлгідегі сұйықтықпен -160 ° C дейін салқындатылған этанмен тез сіңіру арқылы қол жеткізуге болады (6-сурет). Мұздатудың дұрыс әдісі бүкіл әдіс табысының кілті деп аталуы мүмкін, себебі мұз кристалдары тапсырыс берілетін молекулалар туралы ақпаратты бұрмалау арқылы электронды дифракция тудыруы мүмкін.Протеиндердің және нуклеин қышқылдарының жоғары молекулалық массасының арқасында бұл молекулалар сәтсіздікке ұшырайды, сондықтан дереу мұздату кезінде олардың позицияларын өзгертуге немесе өзгертуге уақыт жоқ. Яғни, осы әдіспен жылдам мұздату кезінде биологиялық белсенді молекулалардың құрылымы өзгермейді. Оның көмегімен Dubboche вирустар құрылымын зерттеу үшін алғаш рет криоэлектрондық микроскопты қолданды (7-сурет, M. Adrian және т.б., 1984). Вирустардың криоэлектрондық микроскопиясы.

Сурет. 7 Сол жақта: J. DuBoche тобымен алынған бактериофагтың T4 бейнесі. Сіз бірнеше вирустық бөлшектерді толығымен ажырата аласыз. Оң: Бұл вирустың үш өлшемді моделі. М. Адриан және т.б., 1984 жылғы мақаланың суреті. Вирустардың криоэлектрондық микроскопиясы және ғылыми зерттеулерден.

1990 және 2000 жылдар аралығында криоэлектрондық микроскопия компьютерлік қуаттылықты және аппаратура дәлдігін дамыту арқылы біртіндеп дамып, жетілдірілді. Бірақ криоэлектрондық микроскоптың нақты гүлденуі 2012 жылы басталады. Ол CMOS-ға негізделген электронды детекторлардың пайда болуына байланысты, ол үлгі арқылы өтіп кеткен электрондарды тікелей анықтай алады. Бұл бізге электронды микроскоптардың дизайнын жеңілдетуге, фокустық және сигналдық түрлендірудің кешенді жүйелерін алып тастауға және кездейсоқ шуды тудыруы мүмкін тораптар санын азайтуға мүмкіндік берді.Нәтижесінде криоэлектрондық микроскопия әдісін шешу 2-3 ангстремге дейін артты (8-сурет).

Сурет. 8 Соңғы бірнеше жыл ішінде криоэлектрондық микроскопияның бета-галактозидаз ферменті мысалында шешілуін жақсарту. Vox.com сайтынан сурет

Мәселен, 2017 жылы гемоглобиннің Макс Перуц құрылымын кристаллографиялық анықтағаннан кейін (Max Perutz және Джон Кендру «1962 жылы химиядағы глобулярлық ақуыздардың құрылымын зерттеу үшін Нобель сыйлығын алды) криоэлектрондық микроскопия осы ақуыздың бір молекуласын зерттеуге мүмкіндік берді. Кристаллда және ерітіндіде (сурет 9).

Сурет. 9 Жоғарыда: гемоглобин кристалының рентгенографиясы, J. D. Bernal, I. Fankuchen және Max Perutz, 1938 баптың имиджі. Химотрипсин мен гемоглобинніңсол жақта) және гемоглобин молекуласының 3D-құрылымын рентгенограмма бойынша қалпына келтіреді (оң жақта). Төменде: криоэлектрондық микроскоп арқылы алынған гемоглобин молекуласыныңсол жақта) және осы молекуланың үш өлшемді моделі (оң жақта), М. Хошоуи және т.б., 2017 жылғы суреттер. Гемоглобиннің крио-ЕМ құрылымы 3.2 В-да Volta фазалық тақтайшасымен анықталған. Жоғарғы оң жақта: гемоглобин молекуласының үлгісі rcsb.org

Биологиялық белсенді қосылыстардың құрылымы туралы дәл ақпаратолардың бір-бірімен өзара әрекеттесу ерекшеліктері және олардың биохимиялық процестерге қатысуы фундаментальді түрде де, практикалық мәселелерді шешуде де, мысалы, жаңа препараттарды әзірлеуде және ауруларды емдеудің жаңа әдістерін жасауда маңызды.

Осы саладағы криоэлектронның микроскопиясын практикалық қолданудың мысалы Zika вирусын зерттеу ретінде қарастырылуы мүмкін (10-сурет). Бразилияда 2016 жылы Зиканың эпидемиясы пайда болған кезде зерттеушілер криоэлектрондық микроскопия арқылы вирус құрылымы туралы ақпарат алуына бірнеше ай жұмсады (Д.Сирохи және басқалар, 2016 ж. Zika вирусының крем-EM құрылымы 3.8 Å рұқсаты).

Сурет. 10 Цико вирусының құрылымы криоэлектрондық микроскоптың көмегімен анықталды. Сурет virology.ws

Тағы бір мысал, биыл криоэлектрондық микроскопия герпес вирусының – адамның цитомегаловирус тұқымдарының ірі өкілі капсидінің құрылысын алуға мүмкіндік берді (Х.Ю. және т.б., 2017). Зерттеудің нәтижелері вирусқа қарсы препараттарға арналған молекулалық мақсаттарға айналуы мүмкін вирус капсидінің мүмкін бөлімдерін іздеуге негіз болды.

Аркадий Курамшин


Like this post? Please share to your friends:
Leave a Reply

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: